1、常用微生物染色的方法革兰染色
抗酸染色:分支杆菌属,诺卡放线菌属 。石炭酸复红染色,金永染色 。
芽孢染色:用于区分细菌的芽孢和营养细胞 。结果芽孢染成绿色,营养细胞为红色 。
晶体染色:观察苏云金杆菌不同变种的晶体形状大小 。结果晶体染成紫色,芽孢为透明椭圆形,仅见具有轮廓的折光体 。
鞭毛染色:有赖夫生染色法、银盐染色法,西萨-基尔染色法等 。一般以西萨-基尔(Cesares-Gill)染法效果最佳 。
异染颗粒染色:用于白喉棒状杆菌染色,直接涂片或改良阿伯特法染色 。
墨汁荚膜染色:观察菌体有无荚膜,如新型隐球菌 。碳素墨汁 。
镀银染色:螺旋体
吉姆萨染色:螺旋体
荧光染色
魏申染色(wayson)染色:鼠疫耶尔森杆菌 。
铬酸P、A、S真菌类染色 。结果:曲霉菌、念球菌属、细胞浆菌属、隐球菌属为红紫色 。曲霉菌丝周边紫红色,弹力纤维紫色,背景绿色 。
Mann氏甲基蓝伊红染色法:病毒包涵体染色 。Negri氏小体红色 。
Nacchiavello氏染色:病毒包涵体染色 。结果:包涵体、立克次氏体均染红色,其余组织呈蓝色 。
Crocott-Gomori氏六胺银法:新型隐球菌
碘染色法吉姆萨染色:衣原体
乳酸酚棉蓝染色,糖原染色:真菌,前者适用于所有真菌,呈蓝色 。
吉姆萨染色,瑞氏染色:鞭毛虫,滴虫,锥虫,疟原虫,弓形虫,隐孢子虫等原虫 。
三色染色,碘染色:阿米巴等原虫 。
荧光素吖啶橙染色:疟原虫 。
金胺-酚染色:隐孢子虫 。
甲苯胺蓝,四胺银染色:耶氏肺孢子虫 。
检验常用染色法包括 1）革兰氏染色法 2）抗酸染色法 3）美兰染色法 4）异染颗粒染色法 5）细菌鞭毛染色法 6）荚膜染色法芽孢染色法 7)布氏杆菌科兹洛夫斯基染色法 8)结核杆菌荧光染色法等主要染色法 革兰氏染色法染液配制 1 。结晶紫染液：称取结晶紫（龙胆紫）14g，溶于95%酒精100ml中 ， 配成饱和液，再取饱和液20ml与1%草酸铵溶液（1g草酸铵溶于100ml蒸馏水溶解即成）80ml混匀即成2 。卢戈氏碘液：碘化钾2g于10ml蒸馏水中，再加碘1g，待碘全部溶解后（时间较长）加蒸馏水200ml即成3 。95%酒精4 。（1）石碳酸复红液：称取碱性复红（碱性品红）4g溶于95%酒精100ml中成饱和液，再取饱和液10ml与5%石碳酸溶液（5ml石碳酸溶于100ml蒸馏水）90ml混匀即成，（2）稀释石碳酸复红液：取石碳酸复红液10ml加入蒸馏水90ml即成染色方法：1 。涂片 将菌液直接涂在载玻片上，经培养的菌落要加生理盐水混匀涂片，等待干燥（固定）2 。将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染色1分钟后用水冲去剩余燃料3 。滴加卢戈氏碘液1分钟后水洗，在滴加95%酒精脱色，摇动玻片至紫色不在脱色为止（约需1分钟），水洗4 。用稀释石碳酸复红液复染30秒至1分钟5 。水洗待干，镜检6 。革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色
文章插图
2、革兰氏染色法的有关问题1.分别找两种已知的G+和G-菌 ， 用完全一致的手段对其操作染色，若镜检结果与已知事实相符，则此时可认为染色操作是正确的，结果是可靠的 。
2.分离成单个菌体、在培养基中培养成菌斑，涂板、染色、显微镜就可以找到染色体非常清晰的染色菌体！3. 一般设置一个对照
即取一株生长健壮，且已知其革兰氏染色反应的菌株 ， 与待检测的菌株一同染色 ， 染色时间、染液量一致 。染色后一同做镜鉴 。
一般G+选枯草芽孢杆菌，G-取大肠杆菌 4.
文章插图
3、革兰氏染色法的意义和要点是什么?取经火焰固定的标本片，加结晶紫液于涂片上 ， 染色1分钟，轻轻用水冲去染液；片上加革兰氏碘溶液，作用1分钟，用水冲洗；倾尽玻片上的积水后，滴加适量95%乙醇于涂片上，作用0.5～1分钟，进行脱色；水洗后 ， 以复红染液复染1分钟 ， 水洗净用滤纸吸干后镜检 。脱色是该染色法的关键，注意涂片不再有颜色褪下即停止，脱色时一般不要把染料倾去，应用水把染料浮起再冲去，以免染料颗粒附着在玻片上 。本染色法可用于鉴别革兰氏阳性及阴性菌 。
文章插图
4、革兰染色的原理革兰氏染色原理是细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的 。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中 ， 当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色 。
革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高 ， 当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色 。
革兰氏染色的步骤
细菌经过碱性燃料结晶紫染色，后经过碘液进行媒染，然后用酒精脱色，在一定的条件下 ， 有的细菌媒染后 ， 颜色不被脱去 ， 有的会被脱去 ， 因此会把细菌分成两类 ， 不被脱去的被称为革兰氏阳性菌，脱去的则被称之为革兰氏阴性菌 。
脱色后可以在用红色染料进行复染，阳性菌是紫色，阴性菌则被重新染上了红色 。很多有芽孢的杆菌和大部分的球菌，还有放射菌以及真菌杜辉呈现革兰氏正反应，而弧菌、螺旋体以及大多数的致病性无芽孢杆菌则呈现出副反应 。
文章插图
5、革兰氏染色法的过程及其在细菌分类方面的作用???染色技术
由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差 。所以 ， 除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察 。但是，任何一项技术都不是完美无缺的 。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化 ， 不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意 。
本节包括四部分：
一、染色的基本原理
二、染料的种类和选择
三、制片和染色的基本程序
四、染色方法
一、染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的 。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等 。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应 。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附 。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附 。但是 ， 要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生 。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料 ， 若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用 。
细菌的等电点较低，pH值大约在2―5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中 ， 菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电 。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合 。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色 。
影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性 ， 如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用 。此外，培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等 ， 也都能影响细菌的染色 。
二、染料的种类和选择
染料分为天然染料和人工染料两种 。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚 。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物 。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中 。为使它们易溶于水，通常制成盐类 。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类 。
1、酸性染料
这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐 。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色 。
2、碱性染料
这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐 。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色 。
3、中性（复合）染料
酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核的染色 。
4、单纯染料
这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定 ， 因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudanb）的染料 。
<返回顶端>
三、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同 ， 但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序 。
1、制片
在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团 ， 不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可 。
2、自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些 ， 可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧 ， 小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发 ， 但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形 。
3、固定
标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：
1）杀死微生物，固定细胞结构 。
2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉 。
3）改变染料对细胞的通透性 ， 因为死的原生质比活的原生质易于染色 。
固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上 ， 在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3―4次，共约2―3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色 。
以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍 ， 但是应当指出 ， 在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法 。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1―2%的饿酸等 。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用 。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1―2%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1―2分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥 。
4、染色
标本固定后，滴加染色液 。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热 。染料作用标本的时间平均约1―3分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中 。
若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力 。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行 。
5、脱色
用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色 。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌 。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液 。
6、复染
脱色后再用一种染色剂进行染色 ， 与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察 。革氏染色在酒精脱色后用番红 ， 石碳酸复红最后进行染色 ， 就是复染 。
7、水洗
染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留 。
8、干燥
着色标本洗净后，将标本晾干 ， 或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉 。
9、镜检
干燥后的标本可用显微镜观察 。
综上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检 。
<返回顶端>
四、染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种 。前者用一种染料使微生物染色 ， 但不能鉴别微生物 。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用 。故亦称鉴别染色法 。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法 ， 此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法 。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法 。
1、单染色法
【革兰氏染色四种染液,常用微生物染色的方法】用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察 。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色 。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等 。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等 。使用酸性染料时 ， 必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色 。
单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤 。
染色结果依染料不同而不同：
石碳酸复红染色液：着色快，时间短 ， 菌体呈红色 。
美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色 。
草酸铵结晶染色液：染色迅速，着色深，菌体呈紫色 。
2、革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法 ， 1884年由丹麦医师Gram创立 。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去 ， 有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G―） 。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染 。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色 。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌 ， 螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应 。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样 。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物 ， 它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据 。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低 ， 在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反 。所以染色时的条件要严格控制 。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应 。此外 ， 两类菌的细胞壁等对结晶紫―碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色 ， 阴性菌透性大，易脱色 。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制 。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1）涂片固定 。
2）草酸铵结晶紫染1分钟 。
3）自来水冲洗 。
4）加碘液覆盖涂面染1分钟 。
5）水洗，用吸水纸吸去水分 。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色 ， 30秒后水洗，吸去水分 。
7）蕃红梁色液（?。┤?0秒钟后，自来水冲洗 。干燥，镜检 。
染色的结果 ， 革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色 。
如果有可能，找本细胞的书看看 ， 会有，最好是实验用书，会详细有方法的介绍 。
